Главная » 2014 » Август » 12 » Скачать Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами. Дмитриев, Дмитрий Александрович бесплатно
9:52 PM
Скачать Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами. Дмитриев, Дмитрий Александрович бесплатно
Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами
Диссертация
Автор: Дмитриев, Дмитрий Александрович
Название: Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами
Справка: Дмитриев, Дмитрий Александрович. Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.04 Москва, 2005 131 c. : 61 06-3/1301
Объем: 131 стр.
Информация: Москва, 2005
Содержание:
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1 ВВЕДЕНИЕ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
21 Общие представления о биспецифических антителах
211 История создания биспецифических антител и области их применения
212 Способы получения биспецифических моноклональных антител
213 Тестирование биспецифических моноклональных антител
214 Рекомбинация легких и тяжелых цепей антител в тетрадомах
215 Антигенсвязывающие свойства биспецифических моноклональных антител
216 Применение биспецифических моноклональных антител в твердофазных методах
22 Принцип работы и устройство биосенсора IAsys
Введение:
Гибридомная технология, наряду с обычными моноклональными антителами (МКА), нозволяет получать биспецифические моноклональные антитела (БИАТ), конструируемые методами клеточной инженерии [2, 3]. Достоинство этого метода заключается в возможности получать совершенно однородные молекулы БИАТ, сохраняющие структуру «нолумолекул» родительских антител (рис. 1). Основное различие БИАТ (класса IgG) и обычных моноклональных антител состоит в следуюш;ем. Молекула МКА имеет два антигенсвязывающих сайта. БИАТ также имеют два сайта связывания, но их специфичность различна: первый из сайтов специфичен к одному антигену, второй к другому (рис. 1). /У I I I i. II II II Рисунок 1. Возможная структура комплексов при связывании антител с антигенами, а) Биснецифические моноклональные антитела связываются с двумя разными антигенами; б) и в) родительские моноклональные антитела связываются с двумя одинаковыми антигенами.Актуальность проблемы. БИАТ могут служить «мостиком» между антигеном и маркерной молекулой (например, ферментом). Именно ноэтому многие исследователи считают их конъюгатами нового поколения, поскольку теперь нет необходимости метить МКА [4-7]. Большой массив публикаций свидетельствует о высокой эффективности БИАТ в твердофазных системах [8-16]. Вместе с тем, отсутствуют работы, в которых теоретически и экспериментально сравнивались бы свойства БИАТ и обычных МКА при связывании с иммобилизованным антигеном. Исследование вопроса о связывании БИАТ с иммобилизованным антигеном не только имеет большое значение для использования этого класса биомолекул, по и представляет определенный интерес с точки зрения изучения взаимодействия МКА с иммобилизованными антигенами. -Твёрдая фаза Рисунок 2. Возможная структура комплексов при связывании антител и Fab фрагментов с иммобилизованным антигеном, а) Моновалентное связывание моноспецифических моноспецифических антител; антител; б) в) бивалентное моновалентное связывание связывание биспецифических антител; г) моновалентное связывание Fab фрагментов. С иммобилизованным антигеном МКА (класса IgG) могут связываться как одним антигенсвязывающим сайтом, моновалентно (рис. 2 а), так и двумя антигенсвязываюш;ими сайтами одновременно, бивалентно (рис. 2 б), a БИАТ (класса IgG) представляют собой моновалентные молекулы в отношении каждого из антигенов (рис. 2 в). При использовании МКА в иммуногистохимии, иммуноблоттинге, иммуноферментном анализе (ИФА) и других твердофазных необходима количественная оценка процесса связывания системах антител с иммобилизованным антигеном. Для характеристики связывания МКА особенное значение имеют две величины: аффинность, характеризующая степень сродства антитела к данному эпитопу антигена, и авидность, или общая мера стабильности комплекса антиген-антитело. Различие между аффинностью и авидностью может быть обусловлено способностью антител (например, класса IgG) бивалентно взаимодействовать с иммобилизованным антигеном. За счет бивалентного связывания происходит значительное возрастание эффективности связывания антител с антигеном на твердой фазе [17-28]. Из-за стерических факторов не все антитела способны связываться с иммобилизованным антигеном бивалентно. Наличие бивалентного связывания антител с иммобилизованным антигеном необходимо доказывать не только для каждой пары антитело—антиген, но и для каждого клона антител к данному антигену [21]. Ранее бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном доказывали и изучали путем сравнения нативных антител и их Fab фрагментов [17-28] относительно небольших фрагментов антител, которые включают антигенсвязывающий сайт и образуются в результате обработки антител нанаином. Fab фрагменты могут связываться с иммобилизованным антигеном только моновалентно (рис. 2 г) и, таким образом, служат в качестве инструмента для количественной оценки аффинности. Сравнительный анализ связывания с иммобилизованным 10 антигеном нативных антител и их Fab фрагментов является классической иммунологической моделью для апробации новых методов исследования [29, 30]. Следует отметить, что упомянутое достаточно полноценным. Несовершенство сравнение не является подобного сравнения заключается в том, что структура Fab фрагментов отлична от структуры нативных молекул антител. Имеются данные, что Fc участок может иметь значение для антигенсвязывающей способности антител (например, он может влиять на гибкость молекулы) [31]. С другой стороны, бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном можно изучать путем сравнения констант связывания антител в растворе и на твердой фазе [32]. При этом константа связывания антител в растворе служит в качестве инструмента для количественной оценки аффинности. Однако, иммобилизация антигена на твердой фазе (например, на поверхности иммунного планшета) часто приводит к частичному изменению конформационной структуры белка, изменяющей его антигенсвязывающие свойства [33, 34]. Таким образом, аффинность антител, измеряемая в растворе, не является истинной для экспериментов, в которых антитела связываются с иммобилизованным антигеном. На наш взгляд, идеальной моделью для оценки аффинности моновалентного связывания могут служить БИАТ. Структура «полумолекул» БИАТ тождественна структуре «полумолекул» нативных родительских антител (рис. 1). И за исключением одного из вариабельных участков и первичная, и третичная структура БИАТ совпадает со структурой нативных родительских антител (в том случае, когда обе «полумолекулы» БИАТ относятся к одному подклассу IgG) [2, 3, 35, 36]. Цели и задачи исследования. Целью настояш;ей работы являлось количественное изучение взаимодействия родительских моноклональных и бисиецифических моноклональньгх антител иммобилизованными антигенами. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: 1) Получить аффинно-очищенные моноклональные и образованные от них биснецифические моноклональные антитела. В качестве антигенов бьши выбраны следующие протеины: пероксидаза хрена (HRP), миоглобин человека (Мб) и иммуноглобулин G человека (hIgG). 2) Теоретически рассмотреть равновесные и кинетические антител антител и с закономерности взаимодействия образованных от них обычных моноклональных моноклональных биспецифических иммобилизованными антигенами различной структуры. 3) Экспериментально изучить характер и определить количественные характеристики иммунохимического взаимодействия с различными иммобилизованными антигенами, на нримере трех клонов обычных антител: антимиоглобиновых (анти-Мб), антипероксидазных (анти-HRP) и антител против IgG человека (анти-hIgG); и двух клонов образованных от них биспецифических антител (биспецифические антитела, несущие сайты связывания с миоглобином и пероксидазой хрена (анти-Мб/HRP), и биспецифические антитела, несущие сайты связывания с IgG человека и пероксидазой хрена (анти-hIgG/HRP)). Провести сравнение с использованием иммуноферментного, радиоиммунологического методов и с помощью оптического биосенсора, основанного на принципе «резонансное зеркало» (IAsys). Соотнести результаты, полученные тремя методами. 4) Апробировать иммунохимическую модель, предполагающую сравнительный анализ связывания родительских моноклональных антител и биспецифических моноклональных антител, для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного 12 или бивалентного). В качестве инструмента для оценки аффинности моновапентного связывания иснользовать биспецифические моноклонаиьные антитела. 5) Определить условия бивалентного связывания биснецифических моноклональных антител с различными антигенами одновременно иммобилизованными на твердой фазе. Научная исследования. новизна В и научно-практнческая проведенного значимость внервые результате исследования теоретически и экснериментально были сравнены свойства БИАТ и обычных МКА нри связывании с иммобилизованными антигенами. Изучение этого вонроса имеет большое значение для использования БИАТ в различных твердофазных системах. Экснериментально эффективность связывания БИАТ с иммобилизованными антигенами в сравнении с родительскими антителами изучалась ранее только одной группой исследователей [37], к сожалению, их результаты не интерпретируются существующей теорией. Внервые апробирована иммунологическая модель, предполагающая сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ, для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного). Теперь для внедрения новых методов исследования предлагается использовать именно эту иммунологическую модель. В то время как обычно используют иммунологическую модель, предполагающую сравнительный анализ связывания антител и их F(ab) фрагментов с иммобилизованным антигеном [29, 30]. Также впервые с помощью иммуноферментного метода показано наличие бивалентного связывания БИАТ с двумя антигенами, одновременно адсорбированными на твердой фазе. 13 Важный методический аспект имеет сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ с иммобилизованным антигеном с помощью современного оптического биосенсора IAsys, основанного на принципе «резонансное зеркало» [29, 38-46]. Это метод нового поколения, который в настоящее время начинает активно использоваться для количественной оценки иммунохимических взаимодействий. 14
