Биологическое разнообразие бактерий Bacillus thuringiensis из естественных экосистем
Диссертация
Автор: Калмыкова, Галина Васильевна
Название: Биологическое разнообразие бактерий Bacillus thuringiensis из естественных экосистем
Справка: Калмыкова, Галина Васильевна. Биологическое разнообразие бактерий Bacillus thuringiensis из естественных экосистем : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.16 Иркутск, 2003 142 c. : 61 04-3/422
Объем: 142 стр.
Информация: Иркутск, 2003
Содержание:
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ
11 Распространение Bacillus thuringiensis в природе
1'2 Специфичность действия Bacillus thuringiensis на насекомых
121 Кристаллический дельта-эндотоксин
122 Роль насекомых в специфичности действия дельта-эндотоксина
123 Биологическая активность дельта-эндотоксина
13 Роль спор Bacillus thuringiensis в инсектицидно'сти
14 Биологически активные вещества, синтезируемые Bacillus thuringiensis
141 Гидролитические ферменты
1411 Фосфолипаза С
1412 Протеолитические ферменты 1413 Вегетативный инсектицидный белок VipSA
1414 Хитиназа
142 Другие вирулентные факторы
1421 Термостабильный р-экзотоксин ' 1422 Антибактериальные вещества I 1423 Адгезивные свойства * j • ; ; 15 Сохранение Bacillus thuringiensis в природе \ 16 Изменчивость свойств у культур Bacillus thuringiensis ! ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Бактериальные штаммы ! 22, Насекомые
23 Характеристика бактериальных штаммов
231Среды и условия культивирования бактерий J t 1 I
232 Характеристика штаммов Bthiiringiensis no микроскопии, физиологобиохимическим и серологическим свойствам
233 Определение относительной гидрофобности спор бактериальных штаммов
2,34Тестирова11ие бактериоциногснной активности
24 Получение препаратов чистых спор и кристаллов
241 Определение количества спор и кристаллического белка
25 Получение препаратов секретируемых белков
26 Анализ белков методом электрофореза в SDS-PAGE
27 Биотестирование штаммов " ; ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I 31 Характеристика биологических особенностей mT^iUMOB Bthiiringiensis
32 Характеристика штаммов Bt sspkurstaki ; 321 Кристаллы дельта-эндотоксинов штаммов Bt sspkurstaki
322 Физиолого-биохимические свойства культур Bt sspkurstaki J 323 Антибактериальная активность штаммов Bt sspkurstaki
324, Морфологическая неоднородность штаммов Bt sspkurstaki ! 32,41 Некоторые особенности морфологических вариантов j Bt sspkurstaki ! 3242, Гидрофильно-гидрофобные свойства морфологических I вариантов Bt sspkurstaki •f ! 3,25 Инсектицидность штаммов Bt sspkurstaki i I 33 Вирулеиьность спор Btsspkurstaki
331 Синергизм между спорами и дельта-эндотоксином
34Влияние биологически активных веществ Bt sspkurstaki на инсектицидность \ 341 Инсектицидность культуральных жидкостей Bt sspkurstaki
342 Инсектицидная активность штаммов Bt, несвязанная с дельта-эндотоксином и спорами
3421 Характеристика секрстируемых белков штаммов Bt sspkurstaki ЗА22 Действие секретируемых белков на Choristoimeura occidentalis
35 Оценка колониально-морфологического разнообразия природных популяций Bt sspkurstaki
36, Отбор штаммов для биотестирования
Введение:
Бактерии Bacillus thuringiensis (Bt) используются для регуляции численности насекомых начиная с 60-х годов XX века. Биопестицидами на основе Bt контролируют численность насекомых - вредителей сельского и лесного хозяйства, переносчиков болезней из отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Diptera. Несомненным преимуществом их применения является безопасность для здоровья человека, животных и расиений [Feitelson, 1993].Многочисленные скрининговые программы по выделению штаммов Bt со специфичностью к насекомым различных отрядов показали, что эти культуры изолируются из самых разных источников по всему миру [Миненкова и др., 1996; Aptosoglou et al., 1997; Bemhard et al., 1997; Bravo et al., 1998; Chak et al., 1994; Chilcott, Wigley, 1993; DeLucca et al., 1981; Forsyth, Logan, 2000; Hansen et al., 1998; Hastowo et al., 1992; Kim et al., 1998; Mizuki et al., 1999; Vasquez et al., 1995; Wasano et al., 1999].С 80-x годов для регулирования численности насекомых во всем мире применяются препараты на основе Bt ssp.kurstaki. Вероятно, их широкое использование может приводить к неконтролируемому распространению Bt ssp.kurstaki в экосистемах. Показано, что штаммы этого подвида являются одними из часто встречающихся в природе [Martin, Travers, 1989; Kaelin et al., 1994].Важным условием приспособления к окружающей среде у прокариот является их генетическое разнообразие. Однако вопросу гетерогенности культур Bt ssp.kurstaki уделено необоснованно мало внимания, хотя известно о способности клеток Bt ssp.thuringiensis, dendrolimus, galleriae образовывать морфологически отличные колонии [Бурцева и др., 1973; Барайщук, 1983; Блохина и др., 1984; Абросимова и др., 1985; Ягудин и др., 1986]. Как правило, описывают два основных типа колоний R и S [Кашкова, 1978; Абросимова и др., 1985;]. На специально подобранных эмпирически средах I •> возможно выявить наиболее полный ряд спонтанной изменчивости [Браун, 1968], и это позволяет найти коррелятивные связи между морфологическими и биохимическими свойствами [Милько, 1990; Милько, Егоров, 1991]. У морфологических вариантов Bt ssp.tlmringiensis, dendrolinms, golleriae обнаружены значительные различия по инсс1Сгицидной активности [Бурцева и др., 1973; Каткова, 1979], спорообразованию [Ягудин и др., 1983], синтезу термостабильного экзотоксина [Абросимова и др., 1985], способности усваивать сахарозу [Карабеков и др.', 1982], фагочувстврггельности [Азизбекян, Иетыкса, 1978 ]. Bt продуцирует целый р>гд внеклеточных компонентов, которые MOIуг вносить вклад в вирулентность. Основным фа1Сгором специфичности и эффективности действия Bt является белковый кристаллический токсин, который синтезируется во время спорообразования. Внимание большинства исследователей направлено на изучение свойств, регуляции синтеза и механизма действия этого токсина [Somerville, 1971; Stahly et al., 1978; Knowles et al., 1984; Jarrett, 1985; Haider et al., 1986; Jaquet et al., 1987; Holte, Whitelcy, 1989; Gill et al., 1992; Ellar, 1994; Wright et al., 1997; Oppert, 1999; Rukmini et al., 2000]. Однако во время вегетативного роста и на ранней стадии споруляции Bt продуцирует и другие менее специфичные биологически а1стивные вещества: [З-экзотоксип, гидролитические ферменты, вегетативные инсектицидные белки, антибиотические вещества, поверхностные структуры [Нетыкса и др., 1979; Смирнова и др., 1991; Burgeron, de Baqac, 1967; Edhmd et al., 1976; Smirnoff, Valero, 1977; Luthy, 1980; Favret, Yousten, 1989; Lovgren et al., 1990; Zhang et al., 1993; Donovan et al., 2001]. Данные литературы о продукции этих веществ имеют фрагментарный характер и в основном касаются отдельных штаммов некоторых подвидов. Предполагают, что эти вещества способствуют адаптации бактерий к жизни в естественных экосистемах, а также \югут отражаться на способности насекомых переваривать пищу, на их чувствительности к инсектицидам. Однако продемонстрировано, что только р-экзотоксин и вегетативный инсектицидный белок Vip ЗА вносят вклад в инсектицидную активность [Levinson et al., 1990; Estruch et al., 1996; Yu et al., 1997]. Вклад других дополнительных факторов остается определить, так как известно, что для ряда личинок насекомых споры не требуются и трансгенные растения эффективно действуют против личинок [Гулина и др., 1994;Barstonetal., 1987].В связи с вышеперечисленным была поставлена цель и определены задачи исследования.Цель исследования. Целью данной работы явилось изучение разнообразия вариантов внутри Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki по морфологическим и биохимическим свойствам и роли биологически активных веществ, синтезируемых ими, в энтомопатогенной активности и сохранении в природе.Задачи исследования.1. Оценить морфологическую неоднородность и биохимическое разнообразие штаммов Bt ssp.kurstaki.2. Выявить возможные связи между колониально-морфологическими признаками и рядом физиолого-биохимических, инсектицидных, антибиотических свойств и адгезивностью у культур Bt ssp.kurstaki.3. Определить вклад спор, кристаллического 5-эндотоксина и других секретируемых белков в инсектицидную активность (на примере Choristoneura occidentalis (Lepidoptera: Tortricidae)).4. Изучить колониально-морфологическое разнообразие штаммов Bt, выделенных из природных экосистем, а также штаммов Bt, являющихся контаминантами питательных сред.Научная новизна. Впервые в результате изучения кoлoниaJu.lloлюрфологической исоднород1Юсти штаммов Bt ssp.kurstaki выявлено 6 морфологических вариантов (морфоваров). Фенотипические различия, выраженные в характерном внешнем виде колоний на агаризованной среде, затрагивали и базисные особенности метаболической организации клеток: морфовары различались по синтезу метаболитов (дельта-эндотоксина, вегетативного инсектицидного белка, ба1сгсриоци1юв, адгезинов) и внеклеточных ферментов (уреазы, протеазы, лецитиназы).Впервые было показано, что из естественных экосистем, в том ^шсле из мест, где использовали лепидоцид (биоинсе1Стицид на основе Bt ssp.kurstaki, кристовар К-1, морфовар R), преимун1ественно выделялись штамм!,! Bt ssp.kurstaki к-ристовара К-73 морфоваров г и т.Практическая значимость. Выявленные особенности бактерий Bt ssp.kurstaki могуг послужить основой ДШ1 изучения роли Bt в окружаюи^ей среде.Результаты, гюлученные в ходе исследований, убедительно доказьп^ают необходимость включения спор в биопрепараты дл51 регулирования численности Clioristoneura occidentalis (Lepidoptera: Tortricidae), поскольку в их присутствии аетивность кристаллов повышалась в 100-500 раз.Дшг биотестирования предложен метод отбора штамлюв Bt, выделенных из естественных экосистем, который позволяет значительно сократить количество проверок на насекомых.Апробация работы и иуб.1икации. Результаты исследований бьиш представлены на IV Всесоюзной научной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, январь, 1992); на конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, октябрь, 1993); на Всероссийском научно-производственном совещании "Экологически безопасные и беспестицидные технологии получения растениеводческой продукции" (Краснодар, август, 1994); на конференции "Интродукция ^ннcpoopгaнизмoв в окружающую среду" (Москва, май, 1994); на XIII Ме-л{дународном конгрессе по защите растений (Нидерланды, июль, 1995); на Между народ! юй конфсрегщии "Фундаментальные и прикладные проблемы окружающей среды" (Томск, сентябрь, 1995); на Всероссийской конферегнц^и "Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территорий" (Курган, март, 1998); на XI Съезде Русского энтомологическою общества (С.-Петербург, 1998); на Российской научно-праюгической конференции "Оценка современного состоя1шя микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе", посвященной 100-летию со дня ро'Лчдения профессора Е.В. Талалаева (1'1ркутск, март, 2002), на отчетно!! сессии ИСиЭЖ СО РАН (апрель, 1994), на заседании ми1фобиологическо10 общества (декабрь, 2002).Публикации. По материалам диссертации опублщсовано 18 работ. CxpyKTj'pa и объем диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста; состоит из нведения, 3 1'лав, за1сл1очения, выводов и приложения. Работа илл!ОСтрирована 13 рисунками и 16 таблицами. Список литературы включает 244 работы, из них 191 на иностранных язьишх. В приложении приведена подробная характеристика щтаммов Bt, относящихся к различным подвидам.Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному ру11<дснис рукописи, В.В.Зыряновой и Я.Л.Лозипской - за помощь в выполнении исследований. I I
