Главная » 2014 » Август » 12 » Скачать Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1. Плешкан, Виктор Викторович бесплатно
9:54 PM
Скачать Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1. Плешкан, Виктор Викторович бесплатно
Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1
Диссертация
Автор: Плешкан, Виктор Викторович
Название: Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1
Справка: Плешкан, Виктор Викторович. Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1 : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.03 / Плешкан Виктор Викторович; [Место защиты: Ин-т биоорган. химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН] - Москва, 2009 - Количество страниц: 98 с. ил. Москва, 2009 98 c. :
Объем: 98 стр.
Информация: Москва, 2009
Содержание:
Список сокращений:
ВВЕДЕНИЕ
Цели и задачи работы
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Метилирование и другие эпигенетические факторы, влияющие на экспрессию генов
111 Гистоны и метилирование ДНК
112 Петли хроматина и метилирование ДНК
113 Метилирование при импринтинге
114 Регуляторные белки CTCF и Kaiso
115 Тканеспецифичность транскрипции генов обусловленная метилированием
12 Изменения уровня метилирования при различных патологиях
121 Гипометилирование ДНК
1211 Активация онкогенов
1212 Метилирование мобильных элементов
1213 Хромосомная нестабильность
123 Метилирование ДНК и горячие точки мутаций
13 Особенности транскрипции генов с промоторов не содержащих канонических ТАТА-последовательностей
131 Основные свойства инициаторного элемента (Inr)
132 DPE элемент промотора (Downstream Promotor Element)
133 Проксимальный (PSE) и дистальный (DSE) промоторые элементы
134 МТЕ элемент (Motif Ten Element)
135 DCE элемент (Downstream Core Element)
136 Элементы, специфические для he содержащих ТАТА-последовательность промоторов
137 CpG островки
138 Частные случаи регуляции генов не содержащих ТАТА-последовательность39 1381 Регуляция транскрипции генов NKR-P1 семейства
13811 Структура промотора гена Ly49 и тканеспецифичность экспрессии
13812 Особенности гена KLRB1
1382 Регуляция транскрипции гена PROM1
ГЛАВА 2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
21 Определение тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1
211 Транскрипция в клеточных линиях
212 Транскрипция в эмбриональном легком человека
213 Транскрипция в опухолевых и нормальных тканях легкого и пищевода
214 Исследование тканеспецифичности транскрипции в 5'-областях генов PROM1 и KLRB1
2141 5'-RACE гена KLRB 1
2142 Транскрипция изоформ гена PROM1, отличающихся по содержанию экзона 4
2143 Тканеспецифичность экспрессии транскриптов, инициированных с промоторов Р1 и Р2
22 Определение статуса метилирования участков генов PROM1 и KLRB1
221 Использование деметилирующего агента 5-Аза
222 Бисульфитное секвенирование промоторов Р1 и Р2 гена PROM1
2221 Метилирование промотора Р1
2222 Метилирование промотора Р2
2423 Характер метилирования промоторов Р1 и Р2
223 Анализ метилирования промотора Р2 метил-специфическим ПЦР
224 Метилирование и транскрипция
225 Определение метилирования в протяженных участках генов KLRB1 и PROM1
ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
31 Материалы
311 Ферменты и реактивы
312 Оборудование
313 Расходные материалы
314 Буферные и другие растворы
315 Микробиологические среды
316 Клеточные линии
317 Праймеры, последовательность нуклеотидов
32 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
321 Выделение РНК и геномной ДНК
3211 Выделение РНК
3212 Определение концентрации РНК
3213 Анализ выделенной РНК методом гель электрофореза
3214 Выделение геномной ДНК
3215 Высаживание
322 Обработка ДНКазой
323 Синтез первой цепи кДНК
3231 Построение первых цепей кДНК для ОТ-ПЦР
3232 Контроль на наличие примесей ДНК, "-ОТ" контроль
3233 Построение первых цепей кДНК для 5-RACE
324 ПЦР
3241 ОТ-ПЦР
3242 Геномная ПЦР
3243 Электрофорез
325 Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и ПЦР фрагментов
326 Нуклеотидные последовательности и их анализ
327 Бисульфитное секвенирование
3271 Секвенирование CG-богатых областей генов PROM1 и KLRB1
3272 Секвенирование промоторного участка гена PROM1
328 Молекулярное клонирование
3281 Лигирование
3282 Клонирование
3283 Трансформация
3284 Выращивание ночной культуры клеток
ВЫВОДЫ:
Введение:
Онкологические заболевания являются второй по частоте причиной смертности в развитых странах. При неоплазиях нарушаются механизмы контроля процессов дифференцировки и пролиферации клеток, связанные с нарушением генетического аппарата клеток. Одним из принципиальных моментов в борьбе с опухолью является ранняя диагностика. Для повышения эффективности диагностирования рака на ранних стадиях и выбора путей лечения необходимо выявление общих для большинства опухолей данного типа генов, изменение экспрессии которых сопровождает появление и развитие опухоли. Такие гены называют маркерными. Не всегда эти маркерные гены играют существенную роль в процессах образования и развития опухоли, и ни один из множества исследованных молекулярных маркеров в отдельности не обладает значительной клинической ценностью при анализе гетерогенных опухолей. Однако использование группы характерных генов-маркеров может значительно повысить надежность ранней диагностики заболевания.
С другой стороны, изучение основ регуляции генов, и, в особенности, маркерных, может иметь важное значение для терапии опухоли.
Одной из характеристик определяющих функциональный статус гена является метилирование. Метилирование ДНК вносит свой вклад в механизмы контроля экспрессии генов и играет важнейшую роль в клеточной физиологии. Всё больше данных говорит в пользу того, что определённый характер метилирования генома важен для нормального функционирования клеток и целых органов. Определенный характер метилирования ДНК устанавливается во время эмбрионального развития организма, и его изменения могут привести в дальнейшем к нарушениям развития, преждевременному старению, прогрессии опухолевых заболеваний, подавлению экспрессии онкосупрессоров (гены, подавляющие развитие опухолей). На данный момент накоплено много данных об аберрантном метилировании в различных опухолях, о его корреляции с уровнем экспрессии, стадией развития и происхождением опухоли. Подобное влияние метилирования вероятно проистекает из того, что при его помощи происходит регуляция транскрипции генов. Считается, что метилирование регуляторных элементов генов, таких как промотор, энхансер и инсулятор обычно приводит к супрессии функции гена. Метилирование района интрона - наоборот, может обеспечить активность гена, поскольку в этом случае, метилирование интрона может препятствовать взаимодействию с белками-репрессорами. Неактивное состояние гена так же может быть обусловлено особой компактной структурой хроматина (гетерохроматина), которая образуется в результате взаимодействия ДНК со специфическими хромосомными белками. В некоторых случаях образование такой структуры хроматина объясняют метилированием ДНК и, напротив, деметилирование ДНК может сопровождаться активацией гена.
Обычно уровень метилирования генов сохраняется в процессе развития организма. Однако в зависимости от множества факторов, он может меняться при его взрослении. Подобные изменения могут являться, как нормальным ответом клетки на действующие на нее внешние стимулы, так и происходить в результате неправильной работы каких-либо клеточных систем.
Исследование принципов регуляции маркерных генов, анализ дифференциальной транскрипции генов в нормальных и опухолевых тканях человека, имеет как диагностическое, так и фундаментальное значение. Механизмы, вовлеченные в регуляцию экспрессии генов, вполне могут быть вовлечены в процессы опухолевой прогрессии, и на современном уровне очень важен комплексный подход к изучаемой проблеме, который позволит не только выявить общие принципы регуляции генов, но и предложить эффективные механизмы воздействия па структуры, способствующие развитию опухоли. По этой причине, экспрессируемые на поверхности клеток рецепторные белки, которые могут узнаваться цитотоксическими Т-лимфоцитами и/или моноклональными антителами, являются перспективным объектом для диагностики и для специфически направленной иммунотерапии и иммуномодуляции опухолевых заболеваний.
Рецептор CD161, кодируемый геном KLRB1, экспрессируется NK и NKT-клетками. Оба типа клеток обладают цитотоксической активностью и способны узнавать и уничтожать различные виды клеток, в том числе опухолевые, вирус-инфицированные клетки и чужеродные трансплантанты. Биологическая функция рецептора CD 161 человека до сих пор остается неясной, предполагается, что он может участвовать как в регуляции цитотоксических функций клеток, так и в регуляции продукции цитокинов. Механизмы регуляции экспрессии KLRB1 гена до сих пор не изучены.
Основным конечным продуктом гена PROM1 является трансмембранный гликопротеин CD 133. Он является специфическим маркером гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и, с недавнего времени, используется при скрининге ГСК. Отобранные по маркеру CD 133 клетки обладают большим пролиферативным потенциалом, нежели при ранее использованных маркерах ГСК. Известно, что метастазы, являющиеся во многом причиной смертности от рака, зачастую обладают фенотипом стволовых клеток, и, в частности, несут на своей поверхности характерные маркеры. Иногда такие клетки называют "раковыми стволовыми клетками", благодаря неограниченной способности к делению, устойчивости к апоптозу и лекарствам. Идентификация таких клеток очень важна при прогнозировании и лечении онкозаболеваний. С другой стороны, многими исследователями было показано, что при возникновении рака изменяется экспрессия некоторых генов, участвующих в эмбриональном развитии. Выявление и изучение таких генов дает возможность выяснить причины болезни, пути ее диагностики и лечения.
Ген PROM1 имеет сложную систему регуляции транскрипции. Известно, что транскрипция reuaPROMl инициируется как минимум с пяти альтернативных промоторов, однако, как правило, транскрипция идет с двух основных промоторов: Р1 и Р2. Поскольку все промоторы гена PROM1 входят в состав одного CpG-островка, предполагается, что одним из основных механизмов регуляции промоторов является метилирование.
По современным представлениям, многие молекулярные системы, участвующие в контроле развития организма, могут быть также вовлечены в процесс онкогенеза. Схожесть молекулярных характеристик стволовых и раковых клеток в определенной степени способствует подтверждению этой гипотезы. Тщательный анализ данных по изучению экспрессии генов в клеточных линиях, являющихся производными раковых клеток, параллельно с определением экспрессии в эмбриональных и раковых тканях может иметь большое значение, как для клинической практики, так и для фундаментальной науки. Нами был проведен анализ уровня транскрипции генов в эмбриональных, нормальных взрослых и раковых тканях, поскольку многими исследователями было показано, что при возникновении рака изменяется экспрессия некоторых генов, участвующих в эмбриональном развитии.
Известно, что при неоплазиях зачастую наблюдаются изменения в метилировании генов. На клеточных линиях, как модельном объекте, мы попытались определить существуют ли корреляции между уровнем метилирования потенциально регуляторных участков и экспрессией генов KLRB1 и PROM1.
Цели и задачи работы.
Целью данной работы было исследовать тканеспецифичность транскрипции генов KLRB1 и PROM1 и определить факторы, влияющие на транскрипцию исследуемых генов in vivo.
Были поставлены следующие экспериментальные задачи: определить тканеспецифичность транскрипции исследуемых генов на панели клеточных линий, в эмбриональных и опухолевых тканях человека, определить могут ли гены являться маркерными при раке пищевода и легкого человека. определить влияний метилирования, как одного из эпигенетических факторов регуляции уровня экспрессии генов, на транскрипцию генов KLRB1 и PROM1.
