Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами
Диссертация
Автор: Павлова, Галина Валериевна
Название: Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами
Справка: Павлова, Галина Валериевна. Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами : диссертация доктора биологических наук : 03.00.25 / Павлова Галина Валериевна; [Место защиты: Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН] - Новосибирск, 2009 - Количество страниц: 183 с. 93 ил. Новосибирск, 2009 276 c. :
Объем: 276 стр.
Информация: Новосибирск, 2009
Содержание:
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Межвидовая ксенотрансплантация
12Лечение нейродегенеративных заболеваний методом трансплантации
13 Восстановительный потенциал центральной нервной системы и связанные с ним проблемы трансплантологии
131Формирование глиального рубца и его влияние на регенерацию аксонов
132 Характеристика методов, направленных на улучшение восстановительных свойств ЦНС при повреждениях
14 Нейротрофические факторы (НФ)
141 Понятие и классификация нейротрофических факторов
142 Общая характеристика лигандов семейства ООМ^ОРЬб)
143 Характеристика рецепторов лигандов семейства ОБМ7
144 Индуцируемая ОБМ7 ИЕТ-зависимая передача сигнала внутрь клетки
145 Индуцируемая ООМ7 ИЕТ-независимая передача сигнала внутрь клетки
146 Взаимодействие сигнального пути, индуцируемого вОМ7, с сигнальными путями других факторов
147 Экспрессия и физиологические функции ОБМ7
148 Защитные и восстановительные свойства ОБМР
149 Общая характеристика лигандов семейства N0?
1410 Характеристика фактора роста нервов
1411 Структура фактора роста нервов
1412 Рецепторы ИОЕ V->
1413 Сигнальные каскады, запускаемые N0?
1414 ВВ№ как член семейства N0?
1415 Внутриклеточные каскады, активируемые BDNF
1416 Исследование мышей, нокаутированных по гену BDNF
1417 Свойства BDNF, влияние на дифференцировку нейронов
1418 Влияние нейротрофических факторов на поведение и память
1419 Нейротрофические факторы при нейродегенеративных заболеваниях69 15 Белки теплового шока (Hsp)
151 Классификация Hsp
152 Факторы индукции Hsp
153 Регуляция экспрессии белков семейств Hsp
154 Локализация и свойства Hsp
155 Hsp70v
156 Структурно-функционалный анализ белков семейства Hsp 70
157 Hsp и апоптоз
158 Стресс, адаптация и белки теплового шока
159 Перспективы использования системы Hsp в медицине
1510 Экспрессия шаперонов в головном мозге
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Методы
211 Рестрикция плазмидной ДНК
212 Электрофорез в агарозном геле
213 Выделение фрагментов ДНК из геля
214 Лигирование
215Приготовление компетентных клеток
216 Трансформация компетентных клеток плазмидами
217 Выделение плазмидной ДНК из Е coli в малом объеме
218 Выделение плазмидной ДНК из Ecoli в большом объеме
219Контроль наличия вставки (блот-гибридизация по Саузерну)
2110 Анализ ДНК-последовательностиIll
2111 Конструкции
2112Метод инъекций
2113 Выведение линий
2114 Гибридизация in situ на целых эмбрионах
2115 Очистка плазмид для введения в культуру клеток Млекопитающих
2116 Введение плазмиды в клетки линии НЕК293 при помощи ExGen 500 Transfection Reagent
2117 Введение плазмиды в ЭСК мыши (линия R1) методом электропорации
2118 Выделение суммарного препарата РНК
2119 Проведение электрофореза РНК
2120 Нозерн-блот гибридизация
2121 Электрофорез в ПААГ
2122 Вестерн-блот гибридизация
2123 Культивирование клеток линии НЕК293
2124 Получение мышиных эмбриональных фибробластов
2125 Желатинизирование ?культуральныхчашек
2126 Обработка МЭФ митомицином С
2127 Культивирование ЭСК мыши линии R
2128 Проведение трансплантации
2129 Получение срезов мозга
2130 Иммуноцитохимический анализ
2131 Количественная оценка величины глиального рубца
2132 Ко-культивация фрагмента зачатка спинного мозга эмбриона человека с клетками трансгенной линии НЕК293, экспрессирующей gdnf
2133 Получение первичной^культурьг клеток*Dmelanogaster, трансгенных по гену ngf
221 Реактивы
222 Растворы, среды
223 Вектора
224 Праймера
225 Антитела
226 Линии клеток
3 РЕЗУЛЬТАТЫ
31 Создание трансгенных линий Drosophila melanogaster гомозиготных по нейральному гену млекопитающих
32 Влияние экспрессии нейротрофического фактора на трансгенные клетки
33 Влияние экспрессии нейротрофического фактора на окружающие клетки при ?кокультивации
34 Влияние нейроэктодермы трансгенных линий на окружающие клетки при ксенотрансплантации
35 Влияние белка теплового шока HSP70 дрозофилы на образование рубца при трансплантациях
36 Использование промоторно-регуляторной (п/р) области гена белка теплового шока дрозофилы (Hsp70), в качестве регуляторного элемента при введении чужеродных генов в клетки млекопитающих
37 Использование полученного вектора LP1, содержащего п/р область гена hsp70 дрозофилы <и маркерный ген gfp, в культурах клеток и в целых организмах::
38 Получение конструкции для экспрессии ngf в клетках млекопитающих
39 Изучение влияния гиперэкспрессии ngf при ко-культивации
310 Получение конструкции для экспрессии gdnf в клетках млекопитающих
311 Исследование влияния гиперпродукции белка GDNF на трансгенные клетки
312 Изучение влияния гиперэкспрессии ^о^;/при ко-культивации
313 Изучение влияния гиперэкспрессии gdnf на образования глиальной ткани при трансплантациях
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
Введение:
Известно, что нейродегенеративные заболевания (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и др.), а также ишемический инсульт - важнейшие социальные заболевания, одни из существенных причин инвалидности и смертности людей в трудоспособном и пожилом возрасте. Широкое распространение при лечении этих заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием клеток, с модифицированными генами, обеспечивающими терапевтический эффект. Особенно перспективна возможность, использования региональных -М I ^ I ' » I стволовых клеток самого пациента, индуцированных к развитию в нужном направлении. Наилучшим трансплантационным материалом служат собственные стволовые клетки из красного костного мозга и других тканей, содержащих мезенхимальные стволовые клетки. Однако, так как у интактных региональных стволовых клеток существуют ограничения потенциала дифференцировок, существенное значение имеет разработка способов управления специализацией трансплантируемых клеток и повышения их жизнеспособности, а также способов предотвращения образования рубцовой ткани в местах трансплантации.
Главными факторами, определяющими природу и рост афферентных и эфферентных волокон трансплантатов, являются среда, в которой находятся трансплантаты мозга, ростовые способности трансплантата, наличие или отсутствие рубца на границе между трансплантатом и мозгом хозяина. Однако уже в течение первой недели после операции астроциты реципиента начинают мигрировать в трансплантат и замещать раневой канал глиальным рубцом. При этом в глиальных септах и в участках глиального рубца густота врастающих в имплантат капилляров существенно ниже таковой в окружающей ткани мозга реципиента. Это может привести к весьма недолгому переживанию трансплантата и его полному отмиранию в результате нехватки питательных веществ уже в течение нескольких месяцев после операции, что, в конечном итоге, сводит эффект к нулю. Для достижения лучшей эффективности нейротрансплантации необходима максимальная интеграция трансплантата с мозгом реципиента, что возможно только при отсутствии глио-мезодермальной капсулы (Корочкин, 2000).
Для достижения максимального клеточно- и генно-терапевтического эффекта и обеспечения безопасности для пациента необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в нужном для лечения направлении. В случае удачного подбора таких элементов появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, требующих использования метода трансплантации тканей. В разрабатываемых конструкциях следует предусмотреть возможность управления экспрессией трансгенов. В состав этих конструкций не должны входить неприменимые в настоящее время в клинике вирусные элементы.
Разработка генных конструкций, сдвигающих дифференцировку стволовых и прогениторных клеток в нейральном направлении, и благоприятно влияющих на лприживляемость трансплантата, а также исследование функционирования полученных конструкций в трансфицированных клетках в культуре до и после трансплантации имеют решающее значение для развития клеточной и генной терапии. Этому и посвящена настоящая работа.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
