Главная » 2014 » Август » 18 » Скачать Свойства 5-нетранслируемой области мРНК белка теплового шока человека HSP70. Рубцова, Мария Петровна бесплатно
1:26 AM
Скачать Свойства 5-нетранслируемой области мРНК белка теплового шока человека HSP70. Рубцова, Мария Петровна бесплатно
Свойства 5'-нетранслируемой области мРНК белка теплового шока человека HSP70
Диссертация
Автор: Рубцова, Мария Петровна
Название: Свойства 5'-нетранслируемой области мРНК белка теплового шока человека HSP70
Справка: Рубцова, Мария Петровна. Свойства 5'-нетранслируемой области мРНК белка теплового шока человека HSP70 : диссертация кандидата химических наук : 02.00.10 Москва, 2004 110 c. : 61 04-2/269
Объем: 110 стр.
Информация: Москва, 2004
Содержание:
Список сокращений ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Участки внутреннего связывания рибосомы клеточных мРНК
11 Общая схема инициации белкового синтеза в клетках эукариот
12 Внутренняя инициация трансляции
13 Инициация трансляции по механизму шунтирования
14 Метод поиска IRES-элементов
15 Участки внутреннего связывания клеточных мРНК
151 IRES-элемент мРНК BIP/GRP
152 IRES-элементы мРНК морфогенетических факторов Ultrabithorax и Antennapedia
153 IRES-элемент мРНК протоонкогена с-туе
154 IRES-элемент мРНК N-myc 25 pi 155 IRES-элемент мРНК AML1/RUNX
156 IRES-элемент мРНК NRF
157 IRES-элемент мРНК Smad
158 IRES-элемент мРНК аутоантигена La
159 IRES-элемент мРНК XIAP
1510 IRES-элемент мРНК BAG
1511 IRES-элемент мРНК Apaf-1 32 * 1512 IRES-элемент мРНК FGF
1513 IRES-элемент мРНК PDGF2/c-Sis
1514 IRES-элемент мРНК VEGF
1515 IRES-элемент мРНК PITSLRE
1516 IRES-элемент мРНК р
1517 IRES-элемент мРНК протеинкиназы С5 (РКС) 40 0 1518 IRES-элемент мРНК рецептора IGF-I
1519 IRES-элемент мРНК cat
1520 IRES-элемент мРНК орнитиндекарбоксилазы
1521 IRES-элементы других мРНК клеточных белков 45 IRES-элемент мРНК FMR1 45 IRES-элемент мРНК NDST 46 IRES-элемент мРНК Myt
IRES-элемент мРНК c-jun
IRES-элемент мРНК Mnt
IRES-элемент мРНК Nkx6
IRES-элемент мРНК HIF-la
IRES-элемент мРНК DAP5/NAТ1/Р
IRES-элемент мРНК Сх
IRES-элемент мРНК Сх
IRES-элемент мРНК рецептора эстрогена а
IRES-элемент мРНК Kvl
ГЛАВА 2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Свойства 5'-нетранслируемой области мРНК белка теплового шока человека HSP
21 Особенности инициации трансляции в условиях теплового шока
22 Исследование способности мРНК HSP70 к внутренней инициации трансляции
23 Определение границ IRES-элемента мРНК HSP
24 Делеционный анализ IRES-элемента мРНК HSP
25 Трехмерная модель узнавания инициаторного кодона при инициации трансляции на 5 '-НТО мРНК HSP
ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
31 Реактивы и материалы
32 Плазмидные конструкции, использованные для исследования способности 5'-НТО мРНК HSP70 к внутренней инициации
33 Плазмидные конструкции, использованные для исследования границ IRES-элемента мРНК HSP
34 Плазмидные конструкции, использованные для делеционного анализа IRES-элемента мРНК HSP
35 Клонирование
351 Рестрикция и выделение фрагмента ДНК в легкоплавкой агарозе
352 Лигирование
353 Полимеразная цепная реакция
36 Трансфекция клеток и измерение в них активности люцифераз и Р-галактозидазы
37 Определение целостности РНК методом защиты от рибонуклеаз 82 ВЫВОДЫ 85 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ мРНК матричная РНК
Met-tRNAj инициаторная тРНК рРНК рибосомная РНК
5'-НТО 5'-нетранслируемая область
IRES-элемент участок внутреннего связывания рибосомы elF эукариотический фактор инициации трансляции
HSP 70 белок теплового шока
АТР аденозин-5'-трифосфат
GTP гуанозин-5'-трифосфат
UTP уридин-5'-трифосфат
GDP гуанозин-5'-дифосфат
NTP рибонуклеозид-5'-трифосфат
ПААГ полиакриламидный гель
EDTA этилендиаминтетраацетат
HPRI ингибитор РНКаз из плаценты человека
BiP/GRP78 белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулинов/регулируемый глюкозой белок
NRF репрессор фактора NF-kB
XIAP Х-сцепленный ингибитор апоптоза
BAG-1 белок, ассоциированный с антиапоптотическим геном Вс
Apaf-1 фактор 1, активирующий апоптотические протеазы
FGF2 фактор роста фибробластов
PDGF2/c-Sis фактор роста тромбоцитов
VEGF фактор роста сосудистого эндотелия
IGF-I инсулиноподобный фактор роста I cat-1 переносчик катионных аминокислот
NDST гепарансульфат-А^-ацетилглюкозамин-//-деацетилазаЛУ-сульфотрансфераза
HIF-la индуцируемый гипоксией фактор la
DAP5/NAT1/P97 белок, ассоциированный с гибелью клеток
Сх коннексин
Введение:
Модель инициации белкового синтеза в клетках эукариот, предложенная М. Козак [1], предполагает, что первоначально 40S рибосомная субчастица при участии факторов инициации узнает кеп-структуру на 5'-конце мРНК (кеп-структура представляет собой 7-метилгуанозин, соединенный с 5'-концевым нуклеозидом 5'-5' трифосфатной связью) и связывается с 5'-концевой областью мРНК (рис. 1). Затем 40S субчастица начинает скользить вдоль мРНК (при содействии инициаторных факторов, расплетающих вторичную структуру 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) мРНК), "сканируя" ее в поисках AUG-кодона, находящегося в благоприятном для инициации трансляции нуклеотидном контексте. После этого к 48S комплексу присоединяется 60S рибосомная субчастица, и образовавшийся 80S инициаторный комплекс начинает синтез белка. Данная модель механизма инициации трансляции называется кеп-зависимой или сканирующей.
Следует отметить, что даже если мРНК не содержит кеп-структуры (например, когда она получена с помощью стандартной Т7-транскрипции), ее трансляция в лизате ретикулоцитов кролика идет достаточно активно, уступая лишь в 2-3 раза эффективности трансляции природной кепированной матрицы. В этом случае 40S рибосомная субчастица также "садится" на 5'-конец моноцистронной молекулы эукариотической мРНК, поэтому данный механизм правильнее называть 5'-конец-зависимым. Согласно этой модели посадка 40S рибосомной субчастицы внутри цепи мРНК принципиально невозможна.
Описанная модель предъявляет определенные требования к строению мРНК. Так, подавляющее большинство эукариотических мРНК кепированы, моноцистронны, содержат относительно короткую (50-100 нуклеотидов) и слабо структурированную 5'-НТО. Инициация трансляции таких мРНК происходит, как правило, на ближайшем к 5'-концу AUG-кодоне. m Gpppи О
403 m Gppp m 7Gppp 7 у2
Рис. 1. Схематическое изображение сканирующей модели инициации трансляции эукариотических мРНК.
Впоследствии оказалось, что к ряду мРНК подобный механизм инициации синтеза белка неприменим в силу иного строения их 5'-НТО. Для таких мРНК была предложена модель внутренней (5'-конец-независимой) инициации трансляции. В соответствии с этой моделью 40S рибосомная субчастица связывается с внутренним участком 5'-НТО мРНК, так называемым участком внутреннего связывания рибосомы или IRES-элементом (/nternal /fibosome Entry Site), который может отстоять от 5'-конца мРНК более чем на 100 нуклеотидных остатков. Впервые такой механизм инициации трансляции был предложен для мРНК пикорнавирусов [2,3,4], 5'-НТО которых не кепированы, весьма протяженны, сильно структурированы и содержат до 11 AUG-триплетов, предшествующих истинному инициаторному AUG-кодону.
Впоследствии IRES-элементы обнаружили и в мРНК вирусов других групп. В настоящий момент известно три типа IRES-элементов: тип I (полиовирус) — AUG-кодон отделен спейсером 50-100 нуклеотидов, тип II (EMCV) -- AUG-кодон входит в IRES, тип III (гепатит А) не активен в составе бицистронной конструкции [5].
Белковый синтез на вирусных мРНК обеспечивается трансляционным аппаратом инфицированной клетки млекопитающих, при этом используются канонические факторы инициации. Это послужило основанием для предположения, что некоторые клеточные мРНК также способны к внутренней инициации. Список мРНК млекопитающих, содержащих IRES-элементы, постоянно растет и в настоящее время включает 50-60 мРНК, важных для роста, дифференцировки и функционирования клетки [6]. Тем не менее, молекулярные механизмы внутренней инициации трансляции клеточных IRES-элементов до сих пор неизвестны. Нахождение новых IRES-элементов, а также изучение их строения и функционирования позволит пролить свет на механизм внутренней инициации трансляции.
Для своей работы мы выбрали достаточно простую модель 5'НТО мРНК белка теплового шока человека HSP70. На основании тщательного анализа литературных данных мы пришли к выводу, что 5'НТО мРНК HSP70 должна обладать способностью к внутренней инициации трансляции не только при тепловом шоке, но и в условиях возврата к нормальной температуре. Действительно в условиях теплового шока подавляется активность кеп-связывающего инициаторного фактора eIF4E, что приводит к снижению эффективности кеп-зависимой инициации трансляции.
Очевидно, что инициация синтеза белков теплового шока (и, в частности, HSP70) в гораздо меньшей степени зависит от кепа, чем инициация трансляции других клеточных матриц. Этот вывод подтверждается тем фактом, что мРНК HSP активно транслируются в системах с искусственно пониженным содержанием инициаторного фактора eIF4E. Еще одним доводом в пользу наличия IRES-элемента в мРНК HSP70 является способность к внутренней инициации мРНК белка BiP -- близкого гомолога HSP70, сходного с ним как по строению, так и по функции. Этот белок также относится к шаперонам, и его синтез активируется в условиях стресса. Данная работа посвящена проверке этой гипотезы.
