Главная » 2014 » Сентябрь » 27 » Скачать Влияние трансгенного фактора роста нервов (НГФ) млекопитающих на рост и морфологию клеточных систем. Муркин, Евгений Васильевич бесплатно
6:22 AM
Скачать Влияние трансгенного фактора роста нервов (НГФ) млекопитающих на рост и морфологию клеточных систем. Муркин, Евгений Васильевич бесплатно
Влияние трансгенного фактора роста нервов (НГФ) млекопитающих на рост и морфологию клеточных систем
Диссертация
Автор: Муркин, Евгений Васильевич
Название: Влияние трансгенного фактора роста нервов (НГФ) млекопитающих на рост и морфологию клеточных систем
Справка: Муркин, Евгений Васильевич. Влияние трансгенного фактора роста нервов (НГФ) млекопитающих на рост и морфологию клеточных систем : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.26 Москва, 2007 98 c. : 61 07-3/683
Объем: 98 стр.
Информация: Москва, 2007
Содержание:
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Трансгенные животные как экспериментальная модель
Нейрогенные гены
Белковые продукты генов Notch и Delta
Нейротрофические факторы
Классификация нейротрофических факторов
Фактор роста нервов
Характеристика фактора роста нервов
Сигнальные каскады, вызываемые NGF
Характеристика сигнальных каскадов, вызываемых NGF
Ras-MAPK киназный путь
Генная экспрессия: немедленно ранние гены
Экспрессия задержанно-ранних генов
Фосфолипазный путь
Ras - независимые сигнальные пути
Нейротрофиновый рецептор р75
Использование нейротрофических факторов для лечения некоторых нейродегенеративных болезней
Белки теплового шока (HSP)
Регуляция экспрессии белков семейств HSP
ГЛАВА 2
Материалы и методы
Ферменты и реактивы
Конструкции
Рестрикция
Лигирование
Приготовление компетентных клеток
Трансформация бактерий Е Coli плазмидами
Выделение плазмидной ДНК из Е coli
Электрофорез в агарозном геле
Метод инъекций
Выведение гомозиготных линий мух
Контроль наличия вставки (блот-гибридизация по Саузерну)
Выделение хромосомной ДНК
Рестрикция хромосомной ДНК
Гель-электрофорез ДНК
Перенос ДНК на нейлоновую мембрану
Приготовление меченого зонда
Гибридизация
Контроль экспрессии ( Нозерн блот-гибридизация)
Выделение тотальной РНК
Гель - электрофорез РНК
Перенос РНК на нейлоновую мембрану
Гибридизация
Гибридизация in situ на целых эмбрионах
Приготовление меченого зонда
Сбор и фиксация эмбрионов
Подготовка эмбрионов к гибридизации
Гибридизация
Предадсорбция антител
Отмывка гибридизации и обработка антителами
Окрашивание
Вестерн - блот гибридизация(иммуноблотинг)
Получение белковых лизатов
Фракционирование белков в полиакриламидном геле
Перенос на нитроцелюлозную мембрану
Имуннодетекция
Получение первичной культуры клеток Dmelanogaster, трансгенных по гену ngf
ГЛАВА 3
Результаты
Исследование жизнеспособности клеток мух Dmelanogaster, кокультивированных со срезом мозга млекопитающих с помощью GFP -подобного флуоресцентного белка DsRed
Исследование влияния фактора роста нервов на клетки Dmelanogaster, используемые при ксенотрансплантации
ГЛАВА 4
Обсуждение результатов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
Список сокращений
ADF - аденозиндифосфат AMP - аденозинмонофосфат ARTN - артемин, АТР - аденозинтрифосфат
BDNF - Нейротрофический фактор головного мозга, сАМР - циклоаденозинмонофосфат
CDP - цитозиндифосфат
СМР - цитозинмонофосфат
СТР - цитозинтрифосфат
ДАБ- диаминобензидин
DEPC - диэтилпирокарбонат
DRG - задержанно ранние гены,
EGF - эпидермальный фактор роста
FRET - флуоресцентный резонансный перенос энергии
GDNF - глиальный нейротрофический фактор роста,
GDP - гуанидиндифосфат
GFP - зелёный флуоресцентный белок
GMP - гуанидинмонофосфат
GTP - гуанидинтрифосфат
HSE - элемент теплового шока
HSF, HSTF - фактор транскрипции теплового шока,
Hsp, БТШ - белок теплового шока,
IEG - немедленно ранне гены
МГЭ мобильные генетические элементы
МНС - комплекс гистосовместимости
NGF, ФРН - фактор роста нервов,
NRTN - ньюртурин,
NT - нейротрофин, пн - пара нуклеотидов, PBS - фосфатно-солевой буфер, PSPN - персефин,
DsRed - красный флуоресцентный белок,
SDS додецил сульфат натрия,
TGF-P - трансформирующий фактор роста, тпн - тысяча пар нуклеотидов,
Trk - тирозинкиназа,
ЭДТА - Этилен-диамидтетрауксусная кислота
Введение:
В последние годы всё больше внимания уделяется лечению нейродегенеративных заболеваний, связанных с отмиранием нервных клеток в ЦНС, что приводит к функциональному дефициту.
Для восстановления функционального состояния применяют или трансплантацию незрелой нервной ткани или клеток, или инъекции непосредственно в мозг нейротрофического фактора, стимулирующего рост и дифференцировку нервных клеток. Это является потенциальной возможностью улучшения состояния, возникающего в результате отмирания нейронов.
Критической при трансплантации незрелой нервной ткани или клеток является приживляемость (выживание в новых условиях и образование связей между пересаженными клетками и клетками реципиента) трансплантированных нейронов. Большинство пересаженных клеток отмирают в течение раннего посттрансплантационного периода (Brundin, Р et all, 2000.). На этот процесс влияют многие факторы: неполный обмен кислорода и углекислого газа, питательных веществ и метаболитов вследствие отека, отсутствия васкуляризации и последующего дефицита трофической поддержки и ростовых факторов, а так же влияния клеточного стресса и воздействия свободных радикалов и иммунных медиаторов. Так, при репарации повреждения дорсальных корешков спинального ганглия крыс, аксоны поврежденных дорсальных корешков легко растут в периферический отдел корешков, но сразу останавливаются, когда встречаются с окружением промежуточной зоны. При этом человеческие эмбриональные или фетальные ганглии дорсальных корешков, пересаженные на место нативных, приживаются, протягивают аксоны через спинной мозг взрослых крыс-реципиентов и создают там функциональные связи (Kozlova et all 1995, 1997). Кроме того, клетки из трансплантата так же приживаются и отправляют аксоны через дорсальные корешки и периферическую нервную систему. Однако, при этом, большая часть пересаженных клеток отмирает, скорее всего, в результате недостаточного кровоснабжения, так как вокруг участка трансплантанта образуется глиальный рубец, блокирующий его васкуляризацию и образование связей с хозяйскими нейронами.
Таким образом, метод, состоящий в пересадке эмбриональной нервной ткани имеет низкий процент излечения и требует переодического повторения трансплантации.
Инъекция нейротрофического фактора применяется для стимуляции оставшихся нервных клеток к делению и росту, что замещает отмершие нейроны. Однако данная процедура является травматической для пациента. Кроме того, так как нейротрофический фактор нестоек, этот метод так же требует периодического повторения инъекции.
В последнее время планируется использование трансплантации эмбриональных стволовых клеток для восстановления функционального дефицита нейронов при нейродегенеративных болезнях. Однако, известно, что пересаженные эмбриональные стволовые клетки дают до 30% случаев перерождения в опухолевую ткань, следовательно, преимущества подобного метода так же сомнительны.
Более перспективен метод трансплантации аллогеных (собственных) стволовых клеток. При этом не возникает иммунный ответ на пересаженные клетки, практически не образуется глиальный рубец, однако сохраняется онкологический риск.
В 1990 году Л.И.Корочкин и С.В.Савельев показали, что нервные клетки плодовой мушки D.melanogaster, пересаженные в нервную трубку зародышей амфибий, выживают и образуют связи с нервными клетками реципиента, при этом не образуется глиальный рубец, блокирующий их васкуляризацию {Савельев С.В и др. 1990). Позднее, в опытах Л.И.Корочкина (Korochkin, 2000.) было показанно, что при ксенотрансплантации в мозг крыс нервные клетки D.melanogaster так же выживали в течение минимум месяца и блокировали образование глиального 9 рубца, что способствовало васкуляризации трансплантата и образованию связей с хозяйскими клетками.
Однако, не ясно, будет ли осуществляться экспрессия гена, контролируемого промотором теплового шока в условиях ксенотрансплантации, т.е. в мозге млекопитающих. И будет ли влиять экспрессирующийся нейротрофический фактор на окружающие клетки в условиях ксенотрансплантации. Данная работа была призвана дать ответ на часть этих вопросов.
Целью данной работы было исследование возможности применения клеток D.melanogaster, экспрессирующих при ксенотрансплантации чужеродный фактор роста нервов для восстановления повреждённых участков в мозге млекопитающих.
Для достижения поставленной цели были поставленны следующие задачи:
• исследовать возможность экспрессии гена, находящегося под контролем промотора белка теплового шока в клетках генома D.melanogaster в условиях ксенотрансплантации в мозг млекопитающих
• исследовать возможность применения фактора роста нервов для улучшения приживаемости ксенотрансплантата и стимуляции образования связей между ним и клетками реципиента.
