Главная » 2014»Октябрь»2 » Идентификация и молекулярно-генетический анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих чувствительность к гербициду ацифлюорфену.
9:22 PM
Идентификация и молекулярно-генетический анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих чувствительность к гербициду ацифлюорфену.
Идентификация и молекулярно-генетический анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих чувствительность к гербициду ацифлюорфену
Диссертация
Автор: Апчелимов, Алексей Андреевич
Название: Идентификация и молекулярно-генетический анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих чувствительность к гербициду ацифлюорфену
Справка: Апчелимов, Алексей Андреевич. Идентификация и молекулярно-генетический анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих чувствительность к гербициду ацифлюорфену : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.15 / Апчелимов Алексей Андреевич; [Место защиты: Ин-т общ. генетики им. Н.И. Вавилова РАН] - Москва, 2009 - Количество страниц: 190 с. ил. Москва, 2009 190 c. :
Объем: 190 стр.
Информация: Москва, 2009
Содержание:
ВВЕДЕНИЕ 7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Ведение
I Биосинтез тетрапирролов у высших растений
1 Общие этапы
2 Биосинтез хлорофилла
3 Биосинтез гема
4 Внутриклеточная локализация ферментов
II Регуляция биосинтеза тетрапирролов
1 Генетическая регуляция этапов от глутамата до ProtoIX
2 Генетическая регуляция этапов от ProtoIX до гема
3 Генетическая регуляция этапов от ProtoIX до хлорофилла
III Фотодинамические гербициды
1 Формирование активных форм кислорода в результате ^ нормального функционирования фотосинтетического аппарата
2 Гербициды, повреждающее действие которых зависит от света
3 Ингибиторы протопорфириногеноксидазы
IV Механизмы устойчивости к ацифлюорфену
1 Неспецифические механизмы устойчивости
2 Специфические механизмы устойчивости
V Использование трансгенных растений с изменениями в пути ^ биосинтеза тетрапирролов в сельском хозяйстве
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1 Растительный материал и условия выращивания растений Условия выращивания Состав сред Квитко и MS Морфо-физиологический анализ
2 Виды и штамы бактерий и условия выращивания
Условия выращивания
Состав сред YEB, LB
3 Выделение нуклеиновых кислот Выделение ДНК
Выделение плазмидной ДНК Выделение РНК
Синтез первой цепи кДНК (обратная транскрипция)
Изучение транскрипции генов (ПЦР продуктов обратной транскрипции - ОТ-ПЦР)
Электрофорез в агарозном геле
ЭлюцияДНК из агарозного геля
4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ПЦР в реальном времени Праймеры
Условия проведения ПЦР и ПЦР-РВ Секвенирование
5 Генетическое картирование с использованием ДНК-маркеров
6 Клонирование ПЦР-продуктов и продуктов лигирования Получение компетентных клеток Е coli и A tumefaciens GV3101 Лигирование 58 Трансформация
Рестрикция
7 Определение содержания хлорофилла
8 Компьютерные методы анализа 62 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I Морфологические и генетические особенности мутантов aci
1 Генетический анализ мутантов aci
2 Анализ нуклеотидной последовательности гена A CI5/CHLI1 у мутантов aci5-l, aci5-2 и aci5
3 Анализ производной аминокислотной последовательности белка, кодируемого геном СНЫ 1 у мутантов aci
4 Изучение фенотипических отличий мутанта aci5 от других мутантов по гену CHLI1 и анализ возможной роли гена CHLI2 в функционировании Mg-хелатазного комплекса
41 Анализ взаимодействия мутаций aci5 и cs
42 Анализ транскриптов аллелей гена CHLI 1 у белых растений cs/aci
5 Анализ производной аминокислотной последовательности белков, кодируемых генами СНЫ 1 и CHLI
6 Анализ полиморфизма генов CHLI 1 и CHLI
7 Создание конструкции для агробактериальной трансформации с геном CIILI1 на основе бинарной векторной системы pCAMBIAl 305
71 Клонирование гена CHLI l(At4gl8480) в вектор pGEMu pCAMBIAl305
72 Создание рекомбинантного гена CHLI 1/CHLI 2 на основе бинарной векторной системы рСАМВ1А1305
8 Анализ молекулярно-генетических механизмов устойчивости к ацифлюорфену у мутанта aci5 II Морфологические и генетические особенности мутанта aci
1 Морфо-физиологические особенности мутанта aci
2 Молекулярно-гепетическое картирование гена ACI
3 Анализ нуклеотидной последовательности гена ACI8/ATASE 2 у мутанта aci
4 Анализ производной аминокислотной последовательности белка, кодируемого tquouATASE 2 у мутантов aci
5 Анализ полиморфизма тъшАТАБЕ
6 Анализ молекулярно-генетических механизмов устойчивости к ацифлюорфену у мутанта aci8 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 151 ВЫВОДЫ 153 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
БЛАГОДАРНОСТИ
Введение:
Биосинтез тетрапирролов является одним из центральных процессов у всех фотосинтезирующих организмов. Наиболее активно изучение генетического контроля этого процесса у растений в настоящее время проводится на модельном объекте Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. A.thaliana является классическим генетическим объектом, на котором проведено большинство работ по картированию и идентификации функции генов среди растений за последние десять лет. Это, прежде всего, связано с доступом к полногеномному сиквенсу и широким распространением методов in silico.
На сегодняшний день все этапы биосинтеза тетрапирролов детально исследованы, однако генетическая регуляция этого процесса изучена далеко не полностью. Для большинства фотосинтезирующих организмов гем, сирогем, фитохромобилин и хлорофилл — это конечные продукты пути биосинтеза тетрапирролов, локализованного в хлоропластах, митохондриях, микросомах и цитозоле (Beale, Weinstein, 1990; Tanaka, Tanaka, 2007). Общим предшественником синтеза гема и хлорофилла является протопорфирин IX. Образование гема, участвующего в процессах дыхания и детоксикации клетки, характерно не только для растительных, но и для животных клеток (Beale, Weinstein, 1990; Grimm, 1998). Порфирины способны генерировать синглетный кислород на свету, что ведет к фотоокислительному стрессу, блоку биосинтеза тетрапирролов и гибели растения. Поэтому исследование мутантов, устойчивых и чувствительных к гербицидам, способным ингибировать протопорфириногеноксидазу, может пролить свет как на молекулярно-генетические механизмы устойчивости к фотодинамическим гербицидам, например, ацифлюорфену, который широко применяется на практике, так и на генетические механизмы регуляции генов биосинтеза тетрапирролов.
Мутационный анализ является эффективным подходом для идентификации генов и изучения их функции. На кафедре генетики МГУ 7 получены мутанты, толерантные к ингибитору биосинтеза хлорофилла ацифлюорфену, характеризующиеся измененной окраской побега (Ежова и др., 2001).
Целью работы является идентификация и структурно-функциональный анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих устойчивость к гербициду ацифлюорфену на основе анализа мутантов из коллекции кафедры генетики МГУ.
Задачами работы являлись:
1. Морфо-физиологический анализ мутантов A thaliana aci5 и aci8.
2. Молекулярно-генетическое картирование и позиционное выделение генов ACI5 и ACI8.
3. Сравнительный анализ уровня транскрипции генов, контролирующих биосинтез тетрапирролов у мутантов aci5, aci8 и растений дикого типа расы Dijon, и изучение молекулярно-генетических механизмов толерантности мутантов к ацифлюорфену.
4. Изучение функциональных особенностей гена ACI5 и его гомолога с использованием данных по их внутри- и межвидовому полиморфизму.
Научная новизна. Впервые показано, что ген CHLI 1/ACI5 (At4gl8480), кодирующий субъединицу CHLI Mg-хелатазного комплекса, отвечает за устойчивость к ацифлюорфену. На основании анализа генной экспрессии установлено, что причиной устойчивости мутанта к ацифлюорфену является увеличение потока токсичных порфиринов в сторону образования гема за счет повышения уровня транскрипции генов биосинтеза гема - генов Fe-хелатазы FC1 и FC 2.
Установлено, что гомолог гена СНЫ 1/ACI5 - ген CHLI 2 (At5g45930) в геноме A.thaliana выполняет второстепенную функцию из-за нуклеотидных замен в 3'-терминальном конце гена, и не способен компенсировать утрату функции гена CHLI 1/ACI5 при формирования хлорофилла. Предполагается, что при формировании Mg-хелатазного комплекса белок CHLI 2 из-за измененной последовательности С-конца не может конкурировать с CHLI 1. Анализ внутривидового полиморфизма гена CHLI 2 выявил наличие двух гаплогрупп, одна из которых идет по пути псевдогенезации, а вторая находится под действием стабилизирующего отбора.
Показано, что ген ACI8 идентичен гену ATASE 2 (At4g34740), кодирующему глутаминфосфорибозилпирофосфат амидотрапсферазу, и таким образом впервые показано влияние биосинтеза пуринов de novo на устойчивость к ацифлюорфену.
Установлено, что устойчивость мутанта aci8 к ацифлюорфену связана со снижением уровня транскрипции гена CHLH, кодирующего лимитирующий фермент биосинтеза хлорофилла (субъединицу Н Mg-хелатазного комплекса).
Научно-практическая значимость работы. Изучение функциональных особенностей гомологичных генов A.thaliana CHLI 1 и CHLI 2 вносит вклад в создание комплексной имитационной модели синтеза тетрапирролов у высших растений. Изучение механизмов устойчивости растений A.thaliana к гербициду ацифлюорфену важно для создания трапсгенных растений с контролируемым путем биосинтеза хлорофиллов, гемов и фитохромобилинов, а также устойчивых к фотодинамическим гербицидам. Полученные сведения о нуклеотидных последовательностях нескольких природных рас отправлены в GenBank. Информация о CAPS маркерах aci8caps и aci8snp323, выявляющих полиморфизм между расами Dijon и Columbia, отправлена в базу данных TAIR.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Введение
Высшие растения синтезируют четыре класса тетрапирролов, а именно, хлорофилл, гем, сирогем, и фитохромобилин. Хлорофилл играет основную роль в фотосинтезе, абсорбируя свет и перемещая энергию света (электроны) к другим молекулам. Высшие растения имеют две разновидности хлорофилла, хлорофилл а и b (рис.1). Метальная группа в позиции С7 хлорофилла а заменена группой формила в хлорофилле Ь. Гем - другой закрытый макроцикл, который содержит железо, и играет также жизненноважную роль в различных биологических процессах, включая дыхание и фотосинтез. Подобный гему, сирогем также содержит железо в закрытом макроцикле. Он играет центральную роль (в составе редуктаз) в ассимиляции азота и серы. Фитохромобилин - это линейный тетрапиррол и хромофор фитохрома, который участвует в передачи сигнала к ядру.
Биосинтез тетрапирролов в растениях протекает в пластидах. Последние этапы биосинтеза гема возможно локализованы и в митохондриях. Биосинтетический путь тетрапирролов разветвлен, часть от глутамата до уропорфириногена является общей для всех четырех классов тетрапирролов в высших растениях. Три последующих реакции от уропорфириногена до протопорфирина IX являются общими для синтеза хлорофилла, гема, и фитохромобилина. Наконец, оставшиеся этапы уникальны для каждой ветви пути. Биосинтез тетрапирролов можно разделить на следующие уникальные ветви: ветвь сирогема, ветвь гема, которая включает биосинтез фитохромобилина, ветвь хлорофилла, и цикл взаимного преобразования хлорофилла а и b (рис.1). Цикл хлорофилла помещают в отдельную категорию, потому что этот цикл регулируется отличным механизмом от тех, которые управляют другими ветвями. Цикл хлорофилла имеет характерную особенность - часть его биосинтетического пути метаболизма (последние две реакции цикла) является также частью пути разложения хлорофилла (по Tanaka, Tanaka, 2007).
В покрытосемянных растениях сложность интеграции пути биосинтеза хлорофилла и его промежуточных продуктов потребовала многих лет идентификации генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза тетрапирролов (Beale; 2005; Nagata et al., 2005). Информация, полученная в ходе этих исследований помогает изучать молекулярные структуры ферментов, а структурные модели в свою очередь, помогают детальному пониманию химии ферментов и пути их регуляции.
Все этапы биосинтеза тетрапирролов детально изучены. Показано, что общими предшественниками синтеза гема и хлорофилла являются порфирины, при чрезмерном накоплении которых происходит генерирование синглетного кислорода на свету, что ведет фотоокислительному стрессу (Beale, Weinstein, 1990; Grimm, 1998). Исследование мутантов устойчивых и чувствительных к ацифлюорфену, может помочь понять и использовать на практике молекулярно-генетические механизмы регуляции генов биосинтеза тетрапирролов для контроля устойчивости растений к фотодинамическим гербицидам.
I. Биосинтез тетрапирролов у высших растений
Для детального анализа механизмов устойчивости растений к фото динамическим гербицидам необходимо иметь представление об организации биосинтеза тетрапирролов, его регуляции и взаимодействии с другими клеточными процессами. Ниже представлен обзор биосинтеза тетрапирролов у высших растений, основные этапы которого контролируются ядерными генами.
1.1 Общие этапы
12 цепочки в I и II кольцах в винильные радикалы, что ведет к образованию протопорфириногена IX.
Капропорфириноген III Кобаламины (водоросли, э/бактерии)
Н Ветвь биосинтеза сирогема в)! t
Продолжение на следующей странице
Рисунок 1. Биосинтез тетрапирролов в высших растениях (по Beale, 1999 и Tanaka, Tanaka, 2007). Синими стрелками указаны пути биосинтеза, отсутствующие в высших растениях.
Ветвь биосинтеза хлорофилла Цикл хлорофилла
Протогеы Бипивэрдин fXa Фитохромобилмн
Гидроксиметил-хлорофиллид а
Дивинил Дивинил лротохлорофиплид а хлорофиллид а
Моиоэннил хлорофилл ид а
Хлорофилла
Гидроксимвтил хлорофилл а
Протопорфирии IX
Ветвь биосинтеза гема
Другие соединения гема Фикобилины водоросли.
Mg-npoTonop ин IX
Хлорофилл b 108)
ХлорофидлидЬ
Продолжение
В геноме A.thaliana существует гомолог бактериальной кислород-независимой СРОХ, однако, пока нет доказательств, что этот гомолог кодирует функциональную копропорфириноген-Ш-декарбоксилазу.
Далее в пути биосинтеза протопорфириноген IX-оксидаза (РРОХ) извлекает шесть электронов из протопорфириногена IX, чтобы сформировать протопорфирин IX (ProtoIX). Растительный тип РРОХ - это FAD содержащая оксидаза, молекулярный вес которой - приблизительно 55 kDa (Lermontova et al., 1997; Narita et aL, 1996). Этот тип РРОХ
14 упоминается часто как белок HemY, обнаруженный в Bacillus subtilis, дрожжах и животных. У Escherichia coli есть негомологичный ген, кодирующий РРОХ, названный HemG, молекулярный вес которого - 15kDa. У цианобакгерий предполагают новый тип РРОХ, так как никаких гомологов для генов HemY или HemG в геномах большинства исследованных цианобакгерий не обнаружено (Obornik, Green, 2005).
