Главная » 2014»Август»10 » Скачать Микробный контактный тест на основе Bacillus pumilus для оценки токсичности загрязненных почв и отходов. Галицкая, Полина бесплатно
8:55 PM
Скачать Микробный контактный тест на основе Bacillus pumilus для оценки токсичности загрязненных почв и отходов. Галицкая, Полина бесплатно
Микробный контактный тест на основе Bacillus pumilus для оценки токсичности загрязненных почв и отходов
Диссертация
Автор: Галицкая, Полина Юрьевна
Название: Микробный контактный тест на основе Bacillus pumilus для оценки токсичности загрязненных почв и отходов
Справка: Галицкая, Полина Юрьевна. Микробный контактный тест на основе Bacillus pumilus для оценки токсичности загрязненных почв и отходов : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.16 Казань, 2006 166 c. : 61 07-3/132
Объем: 166 стр.
Информация: Казань, 2006
Содержание:
Введение
Глава 1 Обзор литературы Оценка токсичности индивидуальных веществ, состояния почв и плотных антропо-генных образований с использованием микроорганизмов 10 Общие положения
11 Методы биотестирования
111 Биотестирование с использованием микроорганизмов
1111 Угнетение роста микробной культуры
1 112 Ферментные тесты 14 1113 Тесты, основанные на ингибировании люминесценции
111 Биотестирование с использованием других организмов
12 Методы, основанные на оценке состояния аборигенной микрофлоры
121 Определение состояния почв и плотных антропогенных образований ^ на основе измерения микробной биомассы ф 122 Оценка состояния объектов на основе анализа процессов трансформации азота и углерода в почве
123 Оценка состояния почв на основании измерения ферментативной активности аборигенной микрофлоры
124 Оценка состояния экосистем на основе определения микробного ^ разнообразия и устойчивости сообществ
13 Влияние металлов на микроорганизмы
Глава 2 Материалы и методы исследования
21 Объекты исследования, культивирование, идентификация
211 Объекты исследования
212 Культивирование организмов
213 Идентификация организмов
2131 Экстрагирование ДНК
2 132 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 45 2133 Секвенирование продукта ПЦР
22 Методы биотестирования
221 Биотестирование объектов с использованием Bacillus pumilus КМ-21 47 * 2211 Контактное биотестирование
2212 Биотестирование водных образцов 48 2 213 Элюатное биотестирование
222 Определение дегидрогеназной активности аборигенной ^ микрофлоры почвенных образцов
223 Биотестирование объектов с использованием Paramecium caudatum
224 Биотестирование объектов с использованием Ceriodaphnia affinis
23 Анализируемые образцы
231 Водные растворы
2 32 Искусственно загрязненные почвенные образцы
233 Незагрязненные почвы с различным содержанием органического ^ вещества
234 Почвы, обработанные компостом
235 Модельные образцы отходов
236 Промышленные отходы
24 Обработка и оценка результатов
Глава 3 Результаты и обсуждение
31 Выбор тест-объекта
311 Ростовые характеристики бактерий рода Bacillus
312 Дегидрогеназная активность бактерий рода Bacillus
313 Чувствительность бактерий рода Bacillus к стандартным токсикантам
32 Идентификация тест-объекта
33 Определение опрерационных параметров и стандартизация методики контактного биотестирования
331 Определение операционных параметров методики
3 32 Стандартизация условий биотестирования
3 33 Определение поправочного коэффициента при тестировании ^ почвенных образцов
34 Определение метрологических характеристик методики контактного ^ биотестирования
35 Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих 50%-ный ^ ингибирующий эффект
351 Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих ^ 50%-ный ингибирующий эффект, с помощью линейной модели
352 Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих ^ 50%-ный ингибирующий эффект, с помощью нелинейных методов
36 Анализ токсичности почвенных образцов, содержащих индивидуальные металлы, их смесь и органический токсикант, методами контактного и элюатного 90 биотестирования
361 Анализ токсичности поченных образцов методами контактного и элюатного ^ биотестирования
362 Определение токсичности почвенных образцов на основе оценки дд активности аборигенной микрофлоры
37 Анализ токсичности почвенных образцов, загрязненных хромом и кадмием, в ^ тестах с использованием Р caudatum и С affims
38 Использование методики контактного биотестирования для оценки класса j ^^ опасности промышленных отходов и почв
381 Определение токсичности промышленных отходов
382 Создание ранжировочной таблицы для отнесения отходов к классам j j опасности
383 Определение классов опасности отходов на основании результатов j j ^ биотестирования с использованием В pumilus, Р caudatum и С affinis
Выводы
Введение:
Актуальность работы. Растущая антропогенная нагрузка на экосистемы диктует необходимость разработки системы мер по ее минимизации. Для эффективного природоохранного управления необходима информация о степени опасности загрязняющих веществ для окружающей среды, прежде всего, их токсичности (Filip, 2002; Ладонин, Пляскина, 2004; Feisthauer et al., 2005; Fernandez et al., 2005; Classens et al., 2006; Судницын, 2006). В настоящее время наряду с методами химического анализа для оценки состояния природных и антропогенных объектов все чаще используются биологические методы. Наиболее сложны для анализа плотные многокомпонентные объекты, такие как почва, бытовые и промышленные отходы (Латыпова с соавт., 2002; Malkomes, 2006).
Одно из перспективных направлений в оценке плотных многокомпонентных сред -микробные тесты (Abbondanzi et al, 2003; Van Beelen, 2003; Kookana et al., 2004; Hinojosa et al., 2004; Rajapaksha, 2004). Наиболее разработаны методы, основанные на оценке аборигенной микрофлоры, которые являются достаточно простыми и чувствительными к токсикантам (Хазиев, 2005; Moreno et al., 2006; Sauve, 2006; Palmroth et al. 2006). Однако при интерпретации результатов зачастую возникают проблемы, связанные с отсутствием незагрязненного образца, идентичного анализируемому. Альтернативой указанным методам являются методы биотестирования, основанные на оценке ответной реакции интродуцированной микрофлоры (Ronnpagel et al., 1998; Athiainen et al., 2002). В настоящее время разработано большое количество таких тестов, включая ряд коммерческих, однако в основном они предназначены для оценки токсичности водных образцов (Kapanen, Itavaara, 2001; Селивановская, 2004; Classens et al., 2006). В случае же тестирования плотных образцов обязательная процедура - это получение водного экстракта (ISO 10712: 1995 (Е), 1995; ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.3-99, 1999; ФР. 1.39.2003.00923, 2003; Plaza, 2005; Fjallborg, 2006). Однако результаты, полученные на водных экстрактах, могут недоучитывать тип и количество загрязняющих веществ (Roenpagel et al., 1998; Alonso, 2006). Кроме того, общая проблема методов биотестирования - это отсутствие адекватного подхода к математическому описанию результатов экспериментов.1
Минимизировать недостатки обоих подходов может использование методов контактного биотестирования. В настоящее время такие методы разработаны в основном для высших растений и животных (Feisthauer, 2005; Moreno, 2006), тогда как методы с использованием микроорганизмов - основных агентов круговоротов элементов - в России отсутствуют, а в Европейском Союзе и США находятся в стадии разработки. Перспективным, на наш взгляд, в качестве тест-объекта использовать микроорганизмы, относящиеся к роду Bacillus, которые являются типичными представителями микрофлоры плотных сред, в частности, почв, а в качестве тестовой функции рассматривать активность фермента дегидрогеназы, отражающего общую метаболическую активность клеток.
Цель данной работы - разработка метода контактного микробного биотестирования для оценки токсичности многокомпонентных плотных объектов.
Задачи исследования.
1. Выбрать в качестве тест-объекта штамм, обладающий максимальной дегидрогеназной активностью и высокой чувствительностью к токсикантам, и осуществить его видовую идентификацию с использованием методов молекулярной биологии на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рДНК.
2. Разработать методику контактного биотестирования и определить метрологические параметры методики - прецизионность, повторяемость и интервалы концентраций стандартных токсикантов вызывающих 50% ингибирование тест-функции (ЕС50), в водных и почвенных образцах.
1 Соруководитель работы в области математического моделирования - д.б.н., к.ф.-м.н., профессор Савельев А. А.
3. Определить адекватную математическую модель, описывающую результаты анализа водных и почвенных образцов различными методами биотестирования и методом оценки аборигенной микрофлоры.
4. Определить токсичность модельных почвенных образцов, загрязненных металлами, их смесью и органическим токсикантом, методом оценки активности аборигенной микрофлоры, методом контактного биотестирования с использованием Bacillus pumilus, методами элюатного биотестирования с использованием В. pumilus, инфузории Paramecium caudatum и ветвистоусого рачка Ceriodaphnia affinis и оценить чувствительность методов анализа
5. Разработать ранжировочную систему для отнесения промышленных и бытовых отходов к классам опасности и установить токсичность образцов промышленных отходов для В. pumilus, P. caudatum и С. affinis.
Научная новизна. Впервые предложена методика контактного биотестирования с использованием дегидрогеназной активности бактерии В. pumilus КМ-21 для оценки опасности плотных объектов (почв и отходов). Стандартизированы условия культивирования тест-объекта, подготовки его к тестированию и операционные параметры реакции. Определены метрологические характеристики методики биотестирования - прецизионность, повторяемость и диапазон концентраций стандартных токсикантов (Cr*6, Cd+2), вызывающих 50%-ный ответный отклик тестового параметра (ЕС50).
Впервые проведен сравнительный анализ пяти математических моделей зависимости «концентрация токсиканта - эффект» и показано, что наиболее адекватно описывает реальные результаты кинетическая модель неполного ингибирования.
Впервые на основе изучения различных способов определения токсичности почвенных образцов, искусственно загрязненных индивидуальными металлами, их смесью и органическим токсикантом, установлено, что разработанная методика контактного биотестирования с использованием В. pumilus КМ-21 по чувствительности сопоставима с тестированием на основе аборигенной микрофлоры и превосходит метод элюагного биотестирования с использованием В. pumilus КМ-21. Результаты контактного теста более тесно коррелируют с результатами теста с аборигенной микрофлорой по сравнению с элюатным тестом.
Впервые с использованием разработанной методики определены границы токсичности отходов, позволяющие ранжировать их по классам опасности. Продемонстрировано, что контактный тест с использованием В. pumilus КМ-21 дает возможность выявить большее количество отходов, относящихся к 2 и 3 классам опасности по сравнению с используемыми в настоящее время элюатными тестами на основе низших ракообразных С. affinis и простейших P. caudatum.
Практическое значение работы. По результатам проведенных исследований разработана, стандартизирована и подготовлена к аттестации в органах Госстандарта методика определения токсичности плотных объектов с использованием бактерии В. pumilus КМ-21. Предлагаемая методика опробована для определения токсичности реальных образцов промышленных отходов, образующихся на предприятиях г. Казани. Методика передана на апробацию в Центральную специализированную инспекцию аналитического контроля при МЭПР РТ и в Центральную заводскую лабораторию ОАО «КЗСК». Результаты исследований используются при проведении практических работ по курсам «Экологическое нормирование» и «Управление в обращении с отходами» на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета (КГУ), а также включены в учебное пособие «Теория и методы экологического нормирования» (2006), рекомендованное для обучения студентов и аспирантов экологического факультета КГУ.
Результаты, полученные в исследованиях, могут быть использованы для совершенствования системы почвенного мониторинга и при разработке мер по минимизации негативного влияния промышленных отходов на окружающую среду.
На защиту выносятся следующие положения:
• Разработанная методика контактного биотестирования плотных объектов (почв и отходов) с использованием дегидрогеназной активности бактерии В pumilus КМ-21 является более чувствительной в отношении ряда металлов, их смеси и органического токсиканта по сравнению с элюатной методикой с использованием того же тест-объекта и сопоставима по чувствительности с методикой на основе тестирования аборигенной микрофлоры.
• Установленные метрологические характеристики методики биотестирования (презиционность и диапазон ЕС50 стандартных токсикантов), а также стандартные условия ее проведения позволяют рекомендовать методику для использования в различных лабораториях и получать сравнимые результаты.
• Для всех трех вариантов тестирования (контактное, элюатное биотестирование и оценка активности аборигенной микрофлоры) зависимость «концентрация токсиканта -вызываемый эффект» наиболее адекватно описывается кинетической моделью неполного ингибирования.
• Предложенный способ создания «суррогатного» контрольного образца дает возможность оценить степень негативного воздействия токсикантов в природных образцах и отходах при отсутствии идентичных незагрязненных образцов.
• Установленные границы токсичности, определяемые с использованием предлагаемой методики, позволяют ранжировать отходы по классам опасности для биологических объектов окружающей среды.
Апробация работы. Материалы работы изложены на II Международной научно-практической конференции «Экология: образование, наука, промышленность и здоровье» (Белгород, 2004), VI республиканской конференции «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан» (Казань, 2004), Международных молодежных конференциях «Туполевские чтения» (Казань, 2004, 2005), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы аграрной науки и пути их решения» (Ижевск, 2005), Всероссийской научной конференции «Современные аспекты экологии и экологического образования» (Казань, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Личный вклад автора в работу состоит в выполнении экспериментальной части диссертации, обсуждении результатов и формулировании выводов на их основе. Соавторами публикаций являются научный руководитель д.б.н. Селивановская С.Ю., д х.н., профессор, заведующий кафедрой прикладной экологии Латыпова В.З., сотрудники Гиссенского Университета (ФРГ) профессора Hummel Н., Duering R-A. и Gaeth S., сотрудник Кливлендского университета (Огайо, США) профессор Hung Y-T., участвовавшие в обсуждении результатов В создании программы для математической обработки результатов принимали участие д.б.н., профессор Савельев А.А. и к.х.н., с.н.с. Семанов Д А.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 151 странице; состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 34 рисунка, 15 таблиц. Список литературы содержит 47 отечественных и 249 зарубежных источников.
